三羧酸循環(huán)系列檢測主要基于代謝組學(xué)分析技術(shù)，結(jié)合高效液相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）、氣相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）等方法，對三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵中間代謝物（如檸檬酸、異檸檬酸、α- 酮戊二酸、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸等）進(jìn)行定性和定量分析。

其核心原理是利用不同代謝物在色譜柱中的保留行為差異實(shí)現(xiàn)分離，再通過質(zhì)譜檢測器對分離后的代謝物進(jìn)行特異性識別和定量。通過比較樣品中這些中間代謝物的含量變化，可反映三羧酸循環(huán)的代謝活性及相關(guān)生理病理狀態(tài)。

儀器與試劑

（一）儀器

高效液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜儀（HPLC-MS/MS）：配備合適的色譜柱（如 C18 柱，2.1mm×150mm，3.5μm）、自動進(jìn)樣器、柱溫箱等。

氣相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）：配備毛細(xì)管色譜柱（如 DB-5MS，30m×0.25mm×0.25μm）、電子轟擊離子源（EI）等。

高速冷凍離心機(jī)（轉(zhuǎn)速≥15000r/min，溫度可調(diào)控至 4℃）。

超聲波提取儀。

氮吹儀。

超純水制備系統(tǒng)（如 Milli-Q 系統(tǒng)）。

天平（精度為 0.0001g）。

移液器（10μL、100μL、1mL、5mL 等）。

離心管（1.5mL、10mL、50mL）。

容量瓶（1mL、10mL、50mL、100mL 等）。

微孔濾膜（0.22μm，有機(jī)相和水相）。

（二）試劑

三羧酸循環(huán)中間代謝物標(biāo)準(zhǔn)品：檸檬酸、異檸檬酸、α- 酮戊二酸、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸等，純度均≥98%。

甲醇：色譜純。

乙腈：色譜純。

甲酸：色譜純。

乙酸銨：分析純，用于配制流動相緩沖液。

正己烷：色譜純。

叔丁基甲醚：色譜純。

內(nèi)標(biāo)物：如氘代檸檬酸（citric acid-d4）、氘代琥珀酸（succinic acid-d6）等，純度≥98%。

超純水：由超純水制備系統(tǒng)制備。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

單標(biāo)儲備液的配制：分別準(zhǔn)確稱取一定量的各三羧酸循環(huán)中間代謝物標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇 - 水（體積比 50:50）混合溶液溶解并定容，配制成濃度為 1.0mg/mL 的單標(biāo)儲備液，置于 - 80℃冰箱中避光保存，有效期為 3 個月。

混合中間液的配制：分別準(zhǔn)確移取一定體積的各單標(biāo)儲備液，用甲醇 - 水（體積比 50:50）混合溶液稀釋定容，配制成濃度為 100μg/mL 的混合中間液，置于 - 20℃冰箱中避光保存，有效期為 1 個月。

系列工作標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確移取不同體積的混合中間液，加入適量內(nèi)標(biāo)物（使內(nèi)標(biāo)物濃度保持恒定），用甲醇 - 水（體積比 50:50）混合溶液稀釋，配制成濃度為 0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL 的系列工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

樣品處理

（一）樣品采集與保存

動物組織樣品：采集所需動物組織（如肝臟、心肌等），迅速用預(yù)冷的生理鹽水沖洗去除血液，濾紙吸干水分，切成小塊，放入液氮中快速冷凍，然后轉(zhuǎn)移至 - 80℃冰箱中保存。

細(xì)胞樣品：收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，用預(yù)冷的 PBS 緩沖液洗滌 2-3 次，離心（1000r/min，4℃，5min）棄上清，加入適量液氮冷凍，-80℃冰箱保存。

植物樣品：采集植物組織（如葉片、果實(shí)等），洗凈后用濾紙吸干水分，液氮冷凍后，-80℃冰箱保存。

（二）樣品提取

稱取約 50mg 冷凍樣品置于 1.5mL 離心管中，加入 500μL 預(yù)冷的甲醇 - 水（體積比 80:20）提取液（含內(nèi)標(biāo)物），用組織研磨儀在低溫下研磨至勻漿。

超聲提取 30min（功率 300W，溫度 4℃），然后在 15000r/min、4℃條件下離心 15min，取上清液置于另一離心管中。

向殘渣中加入 300μL 上述提取液，重復(fù)超聲提取和離心步驟，合并兩次上清液。

（三）凈化與濃縮

向合并的上清液中加入 200μL 正己烷，渦旋混合 1min，12000r/min、4℃離心 10min，棄去上層有機(jī)相，保留下層溶液。

將下層溶液轉(zhuǎn)移至氮吹管中，用氮吹儀在 30℃下吹至近干，加入 200μL 甲醇 - 水（體積比 50:50）混合溶液復(fù)溶，渦旋混合 1min。

15000r/min、4℃離心 10min，取上清液通過 0.22μm 微孔濾膜（水相）過濾，濾液置于進(jìn)樣瓶中，待測。

檢測條件

（一）HPLC-MS/MS 檢測條件

色譜條件

色譜柱：C18 柱（2.1mm×150mm，3.5μm）。

柱溫：30℃。

流動相：A 相為 0.1% 甲酸水溶液，B 相為乙腈。

梯度洗脫程序：0-3min，5% B；3-10min，5%-30% B；10-15min，30%-95% B；15-18min，95% B；18-18.1min，95%-5% B；18.1-22min，5% B。

流速：0.3mL/min。

進(jìn)樣量：5μL。

質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子模式切換。

離子源溫度：350℃。

噴霧電壓：正離子模式 4000V，負(fù)離子模式 3500V。

鞘氣壓力：35psi。

輔助氣壓力：10psi。

碰撞氣壓力：1.5mTorr。

檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），各代謝物的母離子、子離子、碰撞能量等參數(shù)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品優(yōu)化確定。

（二）GC-MS 檢測條件（針對部分揮發(fā)性代謝物）

色譜條件

色譜柱：DB-5MS 毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm）。

進(jìn)樣口溫度：250℃。

載氣：氦氣（純度≥99.999%），流速 1.0mL/min。

進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比 5:1。

進(jìn)樣量：1μL。

柱溫程序：初始溫度 60℃，保持 2min；以 8℃/min 升溫至 200℃，保持 3min；再以 15℃/min 升溫至 280℃，保持 5min。

質(zhì)譜條件

離子源：電子轟擊離子源（EI），電子能量 70eV。

離子源溫度：230℃。

接口溫度：280℃。

質(zhì)量掃描范圍：m/z 50-500。

溶劑延遲：3min。

檢測模式：選擇離子監(jiān)測（SIM），根據(jù)各代謝物標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖確定特征離子。

測定步驟

儀器預(yù)熱：打開 HPLC-MS/MS 或 GC-MS 儀器，進(jìn)行預(yù)熱，確保儀器各項(xiàng)性能參數(shù)穩(wěn)定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：將系列工作標(biāo)準(zhǔn)溶液按濃度由低到高的順序注入儀器，每個濃度重復(fù)進(jìn)樣 3 次，記錄各代謝物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積。以各代謝物濃度與內(nèi)標(biāo)物濃度的比值為橫坐標(biāo)，各代謝物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：將處理好的樣品溶液注入儀器，按照上述檢測條件進(jìn)行測定，記錄樣品中各代謝物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積。每個樣品重復(fù)進(jìn)樣 3 次，取平均值。